一、 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑
表格一：實(shí)驗(yàn)儀器
儀器 | 廠家 | 型號 |
細(xì)胞培養(yǎng)箱 | Thermo Scientific | HERA cell CO2 |
低溫高速離心機(jī) | 64R | BECKMAN |
流式細(xì)胞儀 | BD | FACS Calibur |
表格二：試劑
試劑 | 廠家 |
DMEM 培養(yǎng)液 | Hyclone |
PI | Sigma |
PBS 7.4 (0.1 M) | 自配 |
乙醇 | 國藥集團(tuán) |
RNA 酶 | Sigma |
二、 實(shí)驗(yàn)步驟
細(xì)胞培養(yǎng) 取對數(shù)生長期的 A172 細(xì)胞，按 1*105個/mL 以 1mL 體積接種于 6 孔板內(nèi)。無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜,到轉(zhuǎn)染時使細(xì)胞達(dá)到 70％的匯合率。
轉(zhuǎn)染
將 12.5uL siRNA 溶于 387.5uL 無血清的 DMEM 中,混合均勻。
將 12.5uL Lipofectamine 2000 溶于 387.5uL 無血清的 DMEM 中，混合均
勻。在室溫下孵育 5 分鐘。
將上述兩種混合物混合（總體積 800uL）,輕輕混合均勻在室溫下孵育
20 分鐘形成復(fù)合物。
在 6 孔板中每孔加入 800uL 復(fù)合物。十字法混合均勻。
細(xì)胞在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6h 后棄上清液,并加入 10％胎牛血
清的 DMEM 培養(yǎng)液。
固定
培養(yǎng) 48h 后小心吸去上清，胰酶消化并離心收集細(xì)胞（1000rpm/min），棄上清，用預(yù)冷 PBS 洗細(xì)胞 2 次，加入預(yù)冷 70％乙醇， -20℃固定保存。
染色
離心，棄上清；
1mL PBS 洗 1 次，離心；
加入 10uL RNase A（20ug/mL）于 500uL PBS, 37 度 30min 孵育后，離心；
PBS 洗 1 次，離心；
加 10uL PI (50 ug/mL)于 500 uL PBS，室溫避光 30min。
檢測
以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測，汞激發(fā)波長 488nm，計數(shù) 1 萬個細(xì)胞，結(jié)果
使用 Modfit 軟件分析。
三、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
省略
上海市楊浦區(qū)國康路100號2層
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