從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段的原則和注意事項(xiàng)
更新時(shí)間：2020-12-11 點(diǎn)擊次數(shù)：1467次
從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段的原則和注意事項(xiàng)
瓊脂糖是從瓊脂中提取出來(lái)的，其中含有較多的酸根和羥基多糖。目前大多數(shù)級(jí)別的瓊脂糖中含有硫酸酯多糖，這種物質(zhì)能抑制基因克隆中使用的多種工具酶的活性，如DNA限制性內(nèi)切酶、連接酶等，在回收DNA時(shí)應(yīng)盡量減少這些物質(zhì)的污染。
在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，我們通常需要分離純化特定分子量的DNA片段，用于接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)，比如酶切、連接的工作。下面主要介紹從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段的原則和注意事項(xiàng)，其主要原則有兩項(xiàng)：
1、去除DNA樣品中的雜質(zhì)：
瓊脂糖是從瓊脂中提取出來(lái)的，其中含有較多的酸根和羥基多糖。目前大多數(shù)級(jí)別的瓊脂糖中含有硫酸酯多糖，這種物質(zhì)能抑制基因克隆中使用的多種工具酶的活性，如DNA限制性內(nèi)切酶、連接酶等，在回收DNA時(shí)應(yīng)盡量減少這些物質(zhì)的污染。不管用哪種方法進(jìn)行回收DNA，都會(huì)用到2.5 mol/L醋酸銨和乙醇沉淀，再用70%乙醇漂洗數(shù)次，這樣處理，可以有效地去除一些有害的有機(jī)分子和無(wú)機(jī)鹽沉淀。近年來(lái)瓊脂糖的質(zhì)量大為提高，出現(xiàn)了如低熔點(diǎn)瓊脂糖這樣的產(chǎn)品，不但熔點(diǎn)降低，其中含有的對(duì)DNA工具酶有抑制作用的物質(zhì)也很少，所以有些低熔點(diǎn)的瓊脂糖可以直接在其溶液中對(duì)DNA進(jìn)行內(nèi)切酶消化和DNA片段之間的連接反應(yīng)。
2、提高DNA片段的回收率：
DNA的回收率與DNA片段的大小有一定關(guān)系，分子量越大，回收率明顯下降，大于20kb時(shí)，回收率低于20%。這是由于大的DNA片段和DEAE纖維素紙的結(jié)合力強(qiáng)，很難洗脫下來(lái)。DNA片段的含量也和回收率有較為密切的關(guān)系，量越少回收率越低。
回收DNA片段時(shí)應(yīng)注意以下事項(xiàng)：
1、提高DNA上樣量；
2、減小DNA回收時(shí)的洗脫容積，若容積過(guò)大，可先用正丁醇進(jìn)行濃縮；
3、正確選擇回收DNA片段的方法，根據(jù)回收片段的大小選擇適當(dāng)?shù)幕厥辗椒ā?/div>
